Anden generation eDNA analyser

Projektet afsluttet

Hent afslutningsrapport

Automatiserer realtids analyse af eDNA i havet ved hjælp af ’ESP’ (Environmental Sample Processor)

Baggrund

Baggrund

Analyse af e-DNA (environmental DNA) har revolutioneret vores tilgang til indsamling af data til naturforvaltning¹ og metoden er i en rivende teknisk udvikling. Metoden består i at opsamle og oprense DNA fra miljø-prøver – f.eks. fra vand, luft eller jord, der så giver et øjebliksbillede af hvilke organismer, der har været til stede i området. Eksempelvis har metoden med succes været anvendt til at identificere forekomsten af invasive, sjældne eller truede vandlevende dyr via analyse af vandprøver indsamlet i søer². E-DNA baseret monitering har en række fordele i forhold til traditionel monitering. 1) Metoden er sensitiv, så man behøver ikke observere/fange den art man vil monitere. 2) Den kræver ikke specialiseret artskendskab hos de personer der indsamler prøverne, så alle kan i princippet samle ind. 3) Den er ikke destruktiv og gør derfor ingen skade, hverken på de arter man vil monitere eller andre arter. 4) Den er meget omkostningseffektiv, hvilket betyder man får meget monitering for pengene. Der er dog også en række ulemper ved metoden. Den er generelt ikke kvantitativ, så man kan ikke udlede hvor mange individer der er i området, ej heller hvor store eller hvor gamle de er. Derfor kan e-DNA ikke fuldt erstatte traditionel monitering men bør kombineres med den nuværende naturovervågning.

E-DNA analyser i havet

Der er store perspektiver i at anvende e-DNA analyser til monitering af organismer i havet³. Metoden kan bruges til hurtigt at få overblik over hvilke arter der findes i et givet marint økosystem, samt til at monitere forekomsten af sjældne/truede, invasive og nøglearter, der er vigtige for økosystemets funktion eller er kommercielt interessante. Et vigtigt kendetegn for mange marine arter er at de migrerer, det vil sige bevæger sig rundt mellem havområder, f.eks. i forhold til årstider, reproduktion og forekomst af føde. Dette giver store udfordringer for den traditionelle marine overvågning, men også for klassiske, såkaldt ’første generations’ e-DNA analyser’ som kræver, at man manuelt indsamler tidsserier af vandprøver, for at detektere arternes fordeling i tid og rum. Indsamling og processering af høj-marine vandprøver er forbundet med store omkostninger og logistiske udfordringer, f.eks. i forbindelse med adgang til havgående skibe. Samtidig går der typisk lang tid fra indsamling af vand til analysen er afsluttet, hvilket umuliggør en lang række forvaltningstiltag. Der er derfor stort behov for automatiserede ’anden generations’ e-DNA metoder de kan udføre kontinuerte (realtids) analyser af vandets DNA indhold på stedet, og på denne måde følge og forstå arternes bevægelser ind og ud af et område.

Environmental Sample Processor ”ESP”

ESP’en er et ’på stedet’ undervands DNA laboratorium, der suger vandprøver ind, foretager molekylærbiologiske analyser og sender resultaterne tilbage til brugeren i realtid (se Figur 1a,b). ESP’en kan, afhængigt af den ønskede analysefrekvens, fungere autonomt i op til tre måneder. Udviklingen af ESP’en påbegyndtes i år 2000 af Monterrey Bay Research Institute (MBARI). Incitamentet til udviklingen var, at man havde brug for at monitere toksiske algeopblomstringer på den amerikanske vestkyst. Den daværende monitering var meget omkostningstung i forbindelse med anvendelse af skibe til indsamling af vandprøver, og samtidig var der et betydeligt time-lag mellem indsamling og analyseresultat. ESP’en repræsenterer således et gennemprøvet koncept, der både har resulteret i en række spændende forskningsresultateter⁴, men også har bidraget i væsentlig grad til en bedre naturovervågning.

Projektbeskrivelse

Projektet beskrivelse

Formål

1) At anvende og evaluere et unikt undervands, på stedet, automatiseret DNA laboratorium, ’ESP’ til at foretage e-DNA analyser i havet. 2) At anvende ESP’en til forbedret overvågning og forvaltning af en række sjældne, truede, invasive og nøgle-arter i havet.

Projektet vil bidrage til udvikling og afprøvning af unik ny teknologi til overvågning af marine arter (’proof-of-concept’). Metoden testes i udvalgte fokus-arter og kan efterfølgende overføres til en lang række andre arter. Projektet vil levere real-tids data for forekomster af fokus-arterne i større danske farvande. Perspektivet er, at sådanne informationer vil give uvurderlig ny viden om arternes biologi og udvikling af deres udbredelse til brug direkte i Naturforvaltningen og i planlægning af mere detaljerede undersøgelser. For eksempel ved at bidrage med viden om, hvor og hvornår man skal fokusere indsatsen, hvis man skal indfange og studere bestemte marine arter – eksempelvis hvis man ønsker at fange og mærke blåfinnet tun. Ved projektets afslutning bliver alle data gjort direkte tilgængelige via GBIF.org. Resultaterne vil blive formidlet gennem videnskabelige og populærvidenskabelige publikationer, som alle medlemmer af projektgruppen har stor og lang erfaring med.

Status

Status 2020

I projektet har vi videreudviklet, anvendt og evalueret et unikt automatiseret undervands laboratorium, en såkaldt ’ESP’ (Environmental Sample Processor), til at udføre realtids eDNA baseret monitering på stedet i danske havområder.

ESP’en blev først afprøvet og evalueret med succes i Nordsøen Oceanarium i Hirtshals, hvor forekomst af eDNA for udvalgte fiskearter (makrel, rødspætte, skrubbe og ål) kunne sammenlignes med deres faktiske antal. Dernæst blev ESP’en testet to gange i Kattegat og en gang i Nordsøen under naturlige, realistiske forhold, for at evaluere anvendelses-potentialet til regelmæssig overvågning af en række udvalgte arter, herunder sjældne, truede, invasive og nøgle-arter.

Udsætningerne var ikke uden tekniske og logistiske udfordringer, men generelt succesfulde og lærerige. Vi fik realtids eDNA signal for en række af vores målarter, typisk de mere almindeligt forekommende. Vi fandt DNA spor fra endnu flere arter i eDNA arkivprøver, som ESPén opsamlede løbende og som efterfølgende kan analyseres på mere sensitivt udstyr i laboratoriet.

I løbet af projektet har vi med succes transformeret ESP’en fra en prototype, til et instrument, der er målrettet eDNA analyser. Vi har forbedret instrumentets følsomhed og robusthed via optimering af de molekylærbiologiske analyser og opnået en unik ekspertise i forhold til klargøring, udsætning, fejlfinding samt opsætning af langdistance kommunikation og data overførsel af realtids eDNA resultater. ESP’en er endnu ikke et ’plug and play’ instrument, men med vores nuværende optimerede set-up, ekspertise og indsigt, er den klar til nye udfordringer i forhold til spændende forskningsopgaver, samt til praktisk implementering i overvågning af miljø, biodiversitet og biologisk ressource udnyttelse.

Konkrete leverancer i forhold til projektbeskrivelse
Under projektet er der blevet udviklet og testet 13 artsspecifikke detektions-systemer til analyse på ESP’en. Disse systemer har generelt været systemer til de specifikke målarter i ansøgningen, men har også inkluderet andre relevante fokusarter brugt til at belyse moniteringspotentialet under de specifikke case-studier. Til at analysere eDNA fra hajer og rokker, samt hvidnæse (delfin) har vi valgt at fokusere på såkaldt meta-barcoding systemer, der bruges til at opformere og analysere flere arter ad gangen. Totalt er der udviklet systemer til analyse af alle fokusarter i ansøgningen.

Alle inkluderede assays (detektions-systemer) er testet ift. specificitet og sensitivitet i laboratoriet på en såkaldt qPCR maskine (StepOnePlus).

Testene har dannet grundlag for en vurdering af hvor sensitive systemer vil være på ESP’en og om systemet er specifikt for målarten, det vil sige at den ikke giver positivt signal for andre (lignende) arter. Alle qPCR assays har yderligere inkluderet analyse af en såkaldt fortyndingsserie som muliggør bestemmelse af antallet af eDNA kopier i den oprindelige prøve.

Alle inkluderede assays er testet direkte på ESP’en før udsætning, for at sikre maksimal sensitivitet. Dette har for en del assays vedkommende medført et betydeligt optimeringsarbejde for 3-4 detektions-systemer per mission.
Test af sammenhæng mellem mængde af eDNA og antal individer (biomasse) under kontrollerede forhold for enkelte målarter (Nordsøen Oceanarium)

Sammenhængen mellem mængde af eDNA og antal individer (biomasse) blev testet under kontrollerede forhold på Nordsøen Ocenarium. Disse analyser viste at arterne med højest biomasse i akvariet også udviste den højeste koncentration af eDNA. Det er dog ikke muligt at udregne en mere præcis sammenhæng mellem eDNA og biomasse, da eDNA afsondring, transport og nedbrydning er en kompleks proces, der afhænger af mange eksterne miljøfaktorer.
Under projektet har ESP’en været udsat i havet på 3 forskellige lokaliteter, hvor den har filtreret, analyseret og opsamlet eDNA. Denne proces har været besværliggjort af at sensitiviteten af analyserne har været nedsat pga. forskellige stoffer i havvandet – såkaldt hæmning. Dette har ledt til et større arbejde med at optimere metoden på ESP’en, hvilket har ledt til en stor forbedring af robustheden af analyserne og dermed markant forøget potentialet for succesfulde realtids analyser. Yderlige har ESP’en indsamlet tidsserier af eDNA prøver, der kan analyseres for tilstedeværelsen af andre arter. Sådanne prøver udgør en helt unik ressource til at belyse den tidslige variation af eDNA i havet, og vil for alle prøvers vedkommende blive analyseret via såkaldt meta-
barcoding i nærmeste fremtid.

Status 2019

Siden september 2019 har ESP’en været udsat i Nordsøen, ca. 200 km vest fra Esbjerg, for at detektere og indsamle eDNA fra sjældne arter. Til missionen er ESP’en optimeret til at undgå hæmning af analyserne, tage større vandprøver og klargjort til at analysere eDNA fra marsvin, hvilling og makrel i realtid. Arkivprøverne analyseres for eDNA fra f.eks. hvidnæse (delfin), brugde (haj), sildehaj, grønlandshaj og skade (rokke). I samarbejde med forskere fra Aarhus Universitet er akustisk lytteudstyr opsat på fortøjningen, hvilket muliggør analyse af sammenhængen mellem eDNA og tilstedeværelsen af forskellige hvaler. Efter hjemtagning af ESP’en venter et omfattende analysearbejde af realtids- og arkiv-prøverne, samt evaluering af hidtidige resultater. Herefter påbegyndes forberedelserne til en mission tidligt i 2020 omkring invasive arter. Projektet forestås af Post Doc Brian Klitgaard Hansen, Post Doc Magnus Wulf Jacobsen og Professor Einar Eg Nielsen ved DTU Aqua, i samarbejde med DHI Group Danmark.

Siden sidst har Postdocs Brian Klitgaard Hansen, Magnus Wulf Jacobsen og Professor Einar Eg Nielsen ved DTU Aqua udarbejdet et manuskript omkring de første test af ESP’en i Hirtshals akvarie. Yderligere er de indsamlede arkivprøver fra ESP’ens første mission i havet blevet analyseret. Disse prøver blev taget i efteråret 2018 i Kattegat, ca. 10 km fra den svenske kyst ved Lysekil. Her var ESP’en klargjort til at detektere eDNA i realtid fra blåfinnet tun (Thunnus thynnus), og mulige byttefisk som makrel (Scomber scombrus) og hornfisk (Belone belone) og rygstribet pelamide (Sarda sarda), men tog også såkaldte arkivprøver til senere laboratorieanalyse i land. Realtids-analyserene viste spor af blåfinnet tun, men blev ikke valideret under efterfølgende analyse af arkivprøverne, hvilket sandsynligvis skyldes en forurening af instrumentet. DNA fra makrel og hornfisk blev påvist i arkivprøverne i lav koncentration og viser et godt potentiale for at bruge ESP’en til monitering af migrerende arter i havet.

Henover foråret 2019 blev ESP’en optimeret og opgraderet. Blandt andet udviklede og testede vi en metode til at reducere hæmning (inhibering) af vores realtidsanalyser. Dette vil muliggøre forøgelse af prøvetagnings-volumen ved realtidsanalyse og dermed øge sandsynligheden for at kunne finde DNA fra sjældne arter. ESP’en blev yderligere opgraderet med et specielt konstrueret flydemodul, som muliggør pelagisk udsætning og dermed udsætning ved dybder over 20 meter. Der blev udviklet og testet nye detekteringssystemer til sjældne og invasive arter.

Efterfølgende blev ESP’en klargjort til en ny mission for at teste anvendelsen af instrumentet. Denne mission fokuserer på monitering af sjældne arter som hvaler, hajer og rokker (vf. 2 delmål i projektbeskrivelsen). Da mange af disse normalt findes i Nordsøen, valgte vi en lokalitet 200 km vest for Esbjerg, tæt på Dan F platformen, hvor f.eks. marsvin, hvidnæse, og brugde observeres regelmæssigt. ESP’en blev klargjort henover sommeren i DTU Aquas laboratorier i Silkeborg. Dette omfattede molekylære tests, opsætning af reagenser, lækagetest af undervandshuset og test af telekommunikationen. Under denne mission er ESP’en klargjort til at lave realtidsanalyse af eDNA fra marsvin (Phocoena phocoena), hvilling (Merlangius merlangus) og makrel (Scomber scombrus), som findes i større antal i området og dermed vil virke som en positive kontrol.

Et detekteringssystem til hvidnæse (Lagenorhynchus albirostris) blev udviklet men var ikke artsspecifikt og blev derfor ikke brugt. Yderligere arbejder vi på at udvikle et system til at detektere eDNA fra brugde, sildehaj, grønlandshaj og skade i forbindelse med analyse af arkivprøverne. Modsat sidste udsætning behøvede vi ingen hjælp fra eksterne eksperter til selve klargøringen af ESP’en. Eksperter fra MBARI (Monterey Bay Aquarium Research Institute, Moss Landing, CA, USA) bistod dog med råd og vejledning, mens DHI Group Danmark bistod med ekspertise til udvikling og klargøring af fortøjningen. I samarbejde med forskere fra Aarhus Universitet er der blevet opsat akustisk lytteudstyr på selve fortøjningen.

Dette vil muliggøre korrelationsanalyse af tilstedeværelsen af forskellige hvaler og mulige DNA spor i vandet.

ESP’en blev udsat den 10 september og forventes hjemtaget i uge 47. Dette er en forsinkelse ift. vores oprindelige plan og skyldes udfordringer først omkring logistik og telekommunikation, og senere på grund af dårligt vejr. Efter hjem-
tagelsen venter et omfattende analysearbejde af realtids- og arkivprøverne, hvorefter resultaterne fra denne og sidste mission vil indgå i en publicering omkring vores hidtidige arbejde og erfaringer.

Derefter vil forberedelserne til den sidste mission i 2020 omkring invasive arter påbegynde.

Status 2018

En ESP (Environmental Sample Processor) er et undervands DNA laboratorium, der foretager DNA analyser af vandprøver på stedet og sender resultaterne tilbage til brugeren i realtid. I dette projekt tester vi muligheden for at bruge ESP’en til analyse af DNA fra fisk og andre marine organismer i havvand, såkaldt miljø-DNA eller ”eDNA”, som afsondres fra organismerne til det omgivende vand. Analyse af eDNA er en sensitiv, ikke-destruktiv og relativ billig metode til at påvise tilstedeværelsen af specifikke arter i deres naturlige miljø. I starten af 2018 blev ESP’en testet i Nordsøen Oceanarium i Hirtshals. Her analyserede den i 51 dage miljø-DNA (eDNA) i vandprøver fra det store Oceanarium akvarium. Akvariet rummer 4,5 millioner liter vand og indeholder mange af de fiskearter, som findes i den danske del af Nordsøen. Derfor var akvariet et optimalt sted at teste og evaluere muligheden for at bruge ESP’en til at foretage eDNA analyser i havet. Forsøget i Hirtshals er den første test af eDNA analyser fra fisk på ESPén og viste, at den er i stand til at analysere og finde miljø-DNA fra fisk i akvariet.

Den 1 oktober blev ESP’en udsat i havet for at teste dens anvendelse til at dokumentere den blåfinnede tuns vandring til og fra Kattegat og evt. sammenhænge med forekomsten af potentielle byttefisk. Derfor var ESP’en klargjort til at detektere eDNA fra blåfinnet tun (Thunnus thynnus), byttefisk som makrel (Scomber scombrus) og hornfisk (Belone belone) og rygstripet pelamide (Sarda sarda). ESP’en blev udsat i Kattegat på 15 meter vand ca. 10 km vest for den svenske by Lysekil. Udsætningen blev dækket af både danske og svenske nyhedsmedier (blandt andet DR).

En kortere video fra missionen kan ses på DTUs hjemmeside (http://www.aqua.dtu.dk/nyheder/2018/10/robot-sporer-edna-fra-fisk-paa-havets-bund?id=18e6cddd-4a25-4291-bb00-720d481fe25e).

Udsætningen forløb planmæssigt og ESP’en analyserede løbende DNA fra vandet over de følgende 25 dage, hvorefter den blev hjemtaget. Analyserne viste blandt andet spor af blåfinnet tun. Yderligere analyser på land skal i den kommende tid bruges til at dokumentere og validere disse resultater. Projektet forestås af Ph.d. studerende Brian Klitgaard Hansen, Post Doc Magnus Wulf Jacobsen og Professor Einar Eg Nielsen ved DTU Aqua, i samarbejde med DHI Group Danmark.

Oversigt - Projekter